伴有TMEM双等位基因变异的严重骨 [复制链接]

摘要

骨骼发育不良是一组从轻微到致命的骨骼缺陷不同的疾病。本文报道两个不相关家系，他们均有严重的骨骼疾病。在编号NMD02的巴基斯坦家系中，受影响的个体患有多发性骨骼发育不良和严重矮小（＜-8.5SD）。他们表现出日益粗糙的面部特征，突出的腹部和进行性的骨骼变化，让人想起粘多糖病。患者逐渐丧失行动能力，两名年龄最大的患者在20多岁时死亡。在编号Id01的伊朗家系中的患儿面部特征粗糙，严重骨骼发育不良，临床特征与粘多糖病相似。她有身材矮小、颅缝早闭、脊柱后凸和脊柱半脱位，并在5岁时去世。在这两个家系中，外显子组测序分别鉴定出了进化保守基因TMEM（NM_.1）的两个纯合变体c.CT（p.Arg45Trp）和c.dupA（p.Tyr72Ter）。使用人骨肉瘤细胞的免疫荧光和共聚焦研究表明，TMEM定位于高尔基复合体。然而，p.Arg45Trp突变体TMEM蛋白的靶向效率较低，并且定位是点状的。siRNA-Tmem敲低诱导大鼠原代软骨细胞去分化。该研究表明TMEM与一种新疾病的发病机制有关，并提示其在软骨细胞分化中的潜在功能。

临床特点

图1NMD02和ID01家系图及相关表型

图1a为NMD02家系，有7个患病个体，而ID01家系中有一名患病儿童（图1b），患有类似粘脂贮积症IIα/β型（MIM＃）（表1）。

其中，NMD02家族中5名受影响人员是兄弟姐妹，有两名患者（III:5，III:6）在研究进行中去世。5名患者的父母及兄弟均健康没有明显的表型。受影响的同胞具有相似的表型（图1c、d、e）。此外，与年长患者相比，最年轻的受影响个体的表型没有那么严重，推测疾病是进行性的。面部特征的粗化在年龄最大的患者中更为严重。二个受影响的个体（III:5和III:6）由于日益严重的关节挛缩而最终失去行走能力，并在病情晚期卧床不起。她们均在二十岁出头去世。所有受影响的个体认知处于平均水平，患者回答问题和言语不受影响。III:9和III:11病例检测到轻度贫血，但无其他异常。除骨骼x线检查外的临床或影像学检查无法获得。

Id01家系中确认有一名受影响的女孩。6月龄时开始出现症状（图1f）。她有严重的骨骼发育不良、五官粗糙、发育迟缓、矮身材、颅缝早闭、脊柱后凸畸形、髋关节半脱位、牙齿异常、上呼吸道问题和运动障碍。脑MRI显示胼胝体变薄，轻度脑室扩大。心脏超声心动图显示室间隔缺损。生化检查显示Iduronate-2sulfatase活性增加。

图2.X线检查及遗传学检测及验证

x线提示NMD02家系中III:11和III:9（图2a,b）有严重的骨骼发育不良。多发性骨发育不全的一些典型特征和一些额外的异常提示这是一种新型的骨骼畸形，长骨严重突出于干骺端。个体III:11的骨盆x线片显示小髂骨翼、髋臼顶的发育不全和近端髋关节长股骨的异常。骨骼异常在年长的个体中更为严重，支持疾病是进行性发展的。

来自ID01家系的受影响儿童x射线检查显示严重的骨骼发育不良，包括半椎骨、桨形肋骨，髋臼顶部变平等（图2c）。伴有骨骺发育不良和关节盂窝发育不良的肱骨骨干增宽明显。此外，髋部x线片显示髂翼较短，左髋错位。患儿5岁时因呼吸衰竭去世。

遗传学分析

在NMD02家系中，荧光标记的微卫星标记物检测排除了与GNPTAB（MIM＃）、GNPTG（MIM＃）、IDUA（MIM＃）和ARSB（MIM＃）相关的疾病。同时，也不携带粘脂沉积症相关的已知遗传变异。外显子组数据的分析过滤出三个位于染色体14q32上的罕见纯合外显子变异，同时也与NMD02家系的表型分离。只有TMEM基因NM_.1转录本上c.CT（p.Arg45Trp）变异经预测将破坏和影响同源蛋白中保守的氨基酸功能。在所有公共人群数据库中都不存在，在个种族匹配的对照染色体中没有检测到。该变异收录于LOVD（＃），

对ID01家系行trio-外显子组测序，发现患者携带TMEM基因纯合插入变异c.dupA（p.Tyr72Ter），其父母为杂合子携带者。家系中其他23人均未发现纯合变异。所有公共人群数据库都没有收录该变异。该变异收录于ClinVar（SCV）。

TMEM基因及其变异功能研究

TMEM，也称C14ORF，是位于染色体14q32.12上一个高度保守的基因。该基因在哺乳动物中有长短不同的两种选择性剪接体，NM_.1和NM_.1。TMEM蛋白具有一个功能未知的保守结构域（Duf）对应于较长变体（由氨基酸组成，NP_002091.1）第40至位氨基酸（图3b）。较短变体缺少来自N末端的35个氨基酸（图3b）。预测TMEM是一个具有两个ɑ螺旋的跨膜蛋白（图3d）。错义变异p．（Arg45TRP）（NP_002091.1），或P．（Arg7TRP）（NP_.1）分别影响两种亚型的氨基末端第一跨膜片段。预测突变后的色氨酸将成为第一个跨膜片段的一部分，并可能影响运输作用（图3d）。这一预测效果类似TMEM的精氨酸至色氨酸致病性变异对帕金森病的影响（Dengetal.，）。移码变异c.dupA;p.（Tyr72Ter）被预测在两个跨膜区之间的非跨膜片段之间产生截短蛋白，导致该蛋白不稳定。

在线搜索表明TMEM很可能定位于人和小鼠的高尔基复合体与细胞质膜。通过对转染了GFP融合的野生型或突变型TMEM的人骨肉瘤细胞进行共聚焦定位，发现其与高尔基体标记蛋白Giantin发生共定位。相反，野生型和突变型蛋白均不与内质网（PDI）或溶酶体（LAMP1）的标记有共定位。此外GFP融合p.Arg45TRPTMEM明显减少，呈点状。与野生型蛋白相比难以量化荧光强度等差异。

讨论

研究者鉴定了两个不相关家系中可能导致进行性骨骼疾病并伴有严重矮小和早期死亡的TMEM基因的两个新的纯合变异，并提示TMEM可能在代谢方面起作用。这个从来自ID01家系患者检测到的三个溶酶体酶活性异常得到了支持（表1）。先前文献也报道了粘液脂质沉积症患者的溶酶体酶活性升高。而且，两个家系的临床病程都是提示代谢性多系统疾病，可能与TMEM广泛的表达模式有关。

两个家系中受影响的个体与粘脂贮积症IIα/β型患者具有惊人的表型相似性，具体包括矮小、严重进行性骨骼发育不良、严重身体残疾、面部畸形和膨胀的腹部等。然而，这些疾病的致病基因的变异（GNPTAB或GNPTG）均被排除。有趣的是，与TMEM一样，GNPTAB和GNPTG都定位于高尔基复合体。需要进一步研究这三种蛋白是否参与相同的细胞途径。

综上，结果表明，p．（Arg45Trp）变异可能是一种功能性无效等位基因变异，而p．（Tyr72Ter）也可能是一种功能丧失等位基因变异。P．（Arg45Trp）TMEM在高尔基复合体定位的减少可能由于蛋白质的不正确折叠。这可能阻止其掺入到膜中或引起突变体TMEM的降解。软骨siRNA-Tmem基因敲除后诱导大鼠原代软骨细胞的COL2A1标记物形成减少，提示TMEM可能在软骨细胞的分化和骨骼的发育中有更重要的作用。

总之，研究者们发现纯合TMEM变异可能是新型严重骨骼发育不良伴代谢紊乱的遗传学原因。识别更多携带TMEM变异的受影响个体将有利于扩大该病的表型谱系和阐明具体分子机制。